El 24 de diciembre de 1536, el capitán Juan de Ampudia ocupó con sus soldados un sitio llamado la loma de El Azafate, donde habitaba el cacique o yasgüén, para que el Adelantado don Sebastián de Belalcázar viniese a fundar una nueva ciudad. Después de haber sometido a los nativos, Popayán fue entonces declarada fundada el 13 de enero de 1537 por Belalcázar, quien pasaba hacia el norte de Colombia en busca del mítico tesoro de El Dorado. Belalcázar fue también el fundador de otras ciudades importantes como San Francisco de Quito y Santiago de Cali. Contrario a lo que algunas fuentes históricas sugieren, Belalcázar no fundó la ciudad de Pasto, villa que en realidad fundó uno de sus lugartenientes, Lorenzo de Aldana.
El 15 de agosto de 1537, una vez alcanzada la conquista total de Popayán, se llevó a cabo la ceremonia de fundación solemne de "la nueva villa", conservando el nombre indígena de "Popayán". La ceremonia consistió en una primera misa cantada por el presbítero García Sánchez, en un humildetemplo levantado como Catedral sobre el costado sur de la futura plaza. En esta misma ocasión se instaló el primer Cabildo.
Belalcázar había dejado en enero de 1537 como su primer teniente a don Juan de Ampudia y como primer alcalde a don Pedro de Añasco, según cuenta don Juan de Castellanos en sus crónicas. Según el libro del Cabildo, para el mes de abril fueron nombrados como alcaldes ordinarios el capitán don Juan de Ampudia y Francisco García de Tovar, y los señores Francisco de Ciessa y Luis Vejarano, Bartolomé Álvarez y Martín Alonso de Angulo, como regidores; y Juan de Sepúlveda como escribano público del concejo de esta ciudad, quienes se reunieron para señalar los solares donde habrían de construir sus primeras casas los españoles que hasta entonces habitaban las chozas de los pubenenses.
El Escudo de Armas de Popayán fue concedido por la infanta Juana de Austria en nombre de su hermano, el rey Felipe II, por medio de la real cédula dada en Valladolid el 10 de noviembre de 1558.15
En 1540, Sebastián de Belalcázar fue nombrado Primer Gobernador de Popayán. Desde ese momento se instauró el sistema político español en cada ciudad, que incluía Regidores del Cabildo, Alcaldes y Alguaciles y una participación permanente de la Iglesia a través de un clérigo o cura párroco. Belalcázar también se preocupó por dejar una huella duradera en los territorios conquistados, para lo cual trajo de España semillas de cebada, trigo, caña de azúcar, así como numerosos animales domésticos, especialmente ganado vacuno, caballar y porcino, herramientas y muchos elementos más. A Belalcázar le seguirían otros gobernadores como Gómez Serón de Moscoso , natural deMálaga, quien ocupó su cargo en 1561 y llegó a Colombia en compañía de su criado y cuñado Luís de Zapata.
Después de 1550 se inició por Buenaventura la sistemática entrada de ganado vacuno y caballar, lo que contribuyó a que se formaran las haciendas de ganado en Popayán y alrededores. Prosiguió la conquista con el sometimiento de más comunidades indígenas, pero al mismo tiempo se estableció el sistema político que se tradujo en la instauración de una sociedad colonial basada en la explotación del oro, cuya posesión trajo consigo un enorme poder económico y político para las familias allí establecidas.
El auge minero y comercial, así como la posterior llegada de familias españolas de linaje hicieron de Popayán una ciudad muy importante en el Virreinato de la Nueva Granada. En la ciudad residían los dueños de las minas de oro de Barbacoas y el Chocó, quienes con sus riquezas crearon haciendas, construyeron grandes casonas y dotaron a la ciudad de enormes templos con imágenes traídas de España. Juan Antonio Zelaya y Vergara, primer Gobernador de Guayaquil, desempeñó también el cargo de Gobernador y Superintendente de la Real Casa de la Moneda de Popayán, título expedido en El Pardo el 1 de abril de 1770. Conviene subrayar que la economía minera en la Nueva Granada se dio por ciclos. Tuvo un primer escenario en los distritos mineros antioqueños que entró en crisis de 1620-1630 con una recesión que se profundizó hasta 1680. Es aquí donde cobra importancia el escenario de la Gobernación de Popayán, que desde ese momento se convierte en el lugar en el que se amplía el fenómeno minero, con una importancia excepcional en el curso del siglo XVIII, y aún en gran parte del siglo XIX. El auge minero en Popayán creó una nueva dinámica a través del comercio de esclavos al punto que podría hablarse de la sociedad esclavista de Popayán, la cual tuvo un gran significado para la época.16
Popayán compitió con ciudades como Cartagena, Bogotá y Tunja en el número de nobles titulados domiciliados en ellas. Fue, así mismo, la única ciudad junto con la capital, Santafé, en servir de sede a una Casa de Moneda erigida por la Corona española en todo el territorio de la Nueva Granada. Con lo anterior se explica en buena parte el esplendor que esta ciudad vivió durante la época colonial y los primeros asomos de República, todo ello añadido al orgullo genealógico de las familias fundadoras, que basaron la conservación de sus riquezas en una estructura endogámica muy propia de las élites en diferentes culturas y sociedades
